到底有多尴尬？“JAMA Oncology 发表的液体活检双平台对比结果大不同”深度解读
今天上午，一则《JAMA子刊：尴尬了。。两家顶尖基因检测公司给同一批癌症患者做了液体活检，结果竟然大不相同》的文章刷爆了朋友圈，惊坏了小编。本着严谨医学的态度，小编紧急找来医学和生信领域的专家，对这篇报道中的试验设计、数据统计进行了深入分析，看看引发这场信任危机的根源到底是什么？
先划重点
本文所呈现的检测平台间差异确实超出预期。
文章应该披露更多的临床信息、突变丰度、检测位点等详细数据供进一步分析。
从文章提供的有限信息来看，本文中呈现的差异不能证明两家公司的检测平台均不可靠，只需其中一家出现质量失控即可能造成这样大范围的不一致。
除此以外，本文中采用的患者群体并非评估检测平台的最佳选择。
燃石欢迎国内的行业协会组织相似的研究，也同时呼吁液体活检同行一同严守科学和质量底线，切勿为追求高检出率而放松对假阳性的过滤。在纷乱复杂的市场中，假阳性会损害患者的利益，医生的信任，更会最终伤害行业的发展。
事件回顾
JAMA Oncology本月发表文章，来自约翰霍普金斯医学院的两位临床医生报道，在40例晚期前列腺癌患者中，同一时间采集血样，分别送检美国液体活检市场份额领先的两家公司 Guardant Health（以下简称G家）与 Pathway Genomics（以下简称P家），得到的检测吻合率远低于预期。具体结果拆解如下：
9位患者两个检测平台均为全阴结果。
6位患者虽有阳性突变检出，但在两个检测平台重叠覆盖的可进行比较的基因区域中均为全阴结果。
在剩余的25位有可比较阳性结果的患者中，3位患者（12%）两个平台检测结果完全吻合，6位患者（24%）两个平台检测结果部分吻合，16位患者（64%）两个平台检测结果完全不吻合。
这一结果显示了同一份血液样本在不同液体活检平台检测结果的较大差异，因而引发了对于液体活检技术重复性与稳定性的争议。
深入讨论
1. 本文中双平台对比结果的差异到底是平台差异还是样本差异？
在这篇文章中，最为背离预期的就是25位可比较患者中16位患者呈现双平台间检测结果完全不吻合，这样的平台间吻合度显然会为临床应用带来困扰。
下图为本篇文章中所有患者的检测结果呈现。从本图可见，16位作者归为检测结果完全不吻合的患者的可比较基因区域中，有11位患者为仅在P家检出突变，G家为全阴结果，1位患者为仅在G家检出突变，P家为全阴结果，仅4位患者为两家均有阳性结果检出但检出突变不吻合。样本异质性造成的差异应该呈现较为平衡的不一致，而本文中如此不平衡的阳性检出率推测是由于两个检测平台的突变阈值或过滤机制不同造成。
由于本文作者并未提供疾病亚型、治疗史、检出 45 33137 45 14940 0 0 1850 0 0:00:17 0:00:08 0:00:09 3359的具体变异类型及变异丰度等更多信息，因此可供进一步分析的素材有限。但是发表于2015年《Cell》的文章 The Molecular Taxonomy of Primary Prostate Cancer 曾详细报道前列腺癌的分子突变谱，从其中的Fig5A（下图）可见，在前列腺癌中最重要的通路之一，DNA修复通路中，BRCA1突变人群频率仅为1%左右，这一比例也与后续多篇文献报道中呈现的数据符合。
从这些数据来看，在本文的队列中G家的检测突变谱远比P家更为接近前列腺癌的人群突变预期，也可能提示P家检出结果中存在假阳性。以BRCA1基因为例，该基因在前列腺癌中的突变比例极低，在本队列中G家无任何阳性检出，而P家检出了5例患者阳性（16%），远超出预期（1%）。当然，鉴于样本量较小，并且临床信息等更多数据的缺失，以上的比较仅为推测。
2.可能造成这种差异的原因是什么？
若以G家的检测结果为准，本批共40例晚期前列腺癌患者中，血检检出任何阳性突变的患者仅为15例（37.5%），这一方面是由于无论G家还是P家，本文医生送检的panel都并非专门针对前列腺癌的panel。从文中结果呈现也可以看出，一大部分的检测基因（如EGFR、ALK、MET、RET等）并非前列腺癌常见突变基因或是与前列腺癌治疗用药相关的基因，而对前列腺癌较为重要的FOXA1、SPOP等基因在本文检测panel中都无覆盖，这部分影响了对于panel检测能力的评估。
另一方面，本文中较低的阳性检出率都也提示本队列很可能并非一线初诊患者，也许是进展后甚至治疗响应中的患者，这一点从本队列中大部分患者呈现较低甚至极低的PSA水平（PSA在6以上的患者占比不到20%）也可以看出。众所周知，液体活检依赖于血浆中存在足够的ctDNA浓度，因而与肿瘤负荷密切相关。采用低肿瘤负荷的队列，非癌种针对性的panel，可能是造成本文中所报道差异的主要因素。
而更进一步说，前列腺癌这一癌种的突变谱特点是突变事件相对较少，且无明显热点富集，拷贝数变异事件较多，因此前列腺癌在液体活检的应用以及检测平台性能的检测上其实都非最佳的癌种，非小细胞肺癌、乳腺癌、肠癌等多种有明确且有意义的驱动基因变异的实体瘤会是更好的选择。下图是发表在Science Translational Medicine上的一篇经典的不同瘤种间ctDNA突变检测阳性率的比较，从中也可见前列腺癌几乎是脑瘤以外所有实体瘤中阳性率最低的几个癌种之一。
3.液体活检应该预期的重复性与稳定性
1
同一检测平台同样本重复检测一致性极高
下图呈现了燃石内部测试数据中同一批11例患者同一时间抽血分为两份，一份采用Streck管常温运输，一份采用本地分离后血浆干冰运输的检测结果对比，由图可见，不论是突变、融合、扩增多种变异形式的检出，以及所检测到变异的丰度，两份样本不同运输条件都呈现了极高的一致性。
2
国内外多次室间质评亦已验证不同液体活检平台间可达到较好一致性
国内外进行的多次单盲方式的液体活检室间质评均显示，多家检测平台均可以达到对所有测试位点的准确检出，这也从侧面证实不同平台间对于同样样本可以达到较好的一致性。
3
丰度较低的突变以及意义不明确的突变位点可能存在更高检测差异性
实践证实，丰度越低的突变位点，样本质量及测序深度等检测参数对其稳定检出的影响越大，因此呈现检测间差异的可能性更高。而意义明确的突变位点，例如PCR等传统方法学可以覆盖的EGFR、BRAF、KRAS等基因的热点突变，由于这些位点已经在技术平台建立过程中经历反复验证与性能评价，其检测重复性与稳定性会显著好于意义不明确的突变位点。
延伸阅读
几个月前JAMA Oncology就曾发表一篇FMI与Guardant的比较文章，在那篇文章中，9名不同的实体瘤患者进行了组织与血液的NGS检测比较，组织采用FMI F1 315基因panel，血液采用了Guardant G360 70基因panel，并且仅比较了其中两个panel重叠的区域。在9名患者中，1名患者2个panel均为全阴结果，2名患者在2个panel间无重合突变检出，剩余的6个患者中也仅有1名患者的全部检出突变在两份报告中完全吻合，其余患者均有不吻合的突变。整体来说，所有检出突变中仅有22%的突变在两个检测平台间是吻合的。
然而，这篇文章针对吻合与不吻合的突变之间的对比可见，绝大部分不吻合的突变存在于突变丰度低于1%的血检突变位点上，这与预期是符合的，由于这部分突变位点可能更多地反映了存在异质性的肿瘤亚克隆。而且该研究最大的漏洞是血和组织的采样时间也并非同一时间，因此对结果还需谨慎解读。
燃石医学成立于2014年，专注于为肿瘤精准医疗提供最具临床价值的精准二代基因检测（NGS），针对不同癌种和不同临床阶段的32种检测产品涉及肿瘤良恶性检测、肿瘤靶向用药伴随检测、肿瘤复发监控及肿瘤遗传检测。
燃石医学拥有中国第一间（也是目前唯一）获得美国CLIA认证的ctDNA和肿瘤组织二代测序临床检测实验室，公司与全国各省300多家顶尖医院广泛开展合作，并累积有中国最大肺癌基因组数据库。
此外，燃石医学提供一站式NGS平台解决方案，致力于推进NGS检测落地医院病理科，惠及更多肿瘤患者。目前，燃石是首个通过国家食品药品监督管理总局（CFDA）审核进入《创新医疗器械特别审批程序》的肿瘤应用方向NGS公司，更已于近期获得CFDA发出的首张基于Illumina测序平台肿瘤应用方向NGS检测产品的《医疗器械注册申请受理通知书》。